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| Un protocole de clonage in vitro à partir de hampe florale https://orchidouxdingues.info/viewtopic.php?f=26&t=30677 |
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| Auteur: | franck b77 [ Sam Mai 26, 2012 11:59 pm ] |
| Sujet du message: | Un protocole de clonage in vitro à partir de hampe florale |
J’expose ici ma méthode de clonage in vitro des phalaenopsis à partir de hampe florale. - Réaliser l’expérience sur une hampe florale en cours de floraison et portant, à sa base, 3 ou 4 bourgeons dormants recouverts de leur bractée. - Eliminer la partie de hampe portant des fleurs, le but de l’expérience étant de réveiller et de faire évoluer en plantule les bourgeons placés à la base de la hampe. - Tronçonner la partie de hampe conservée en fragments de 3 à 4 centimètres de sorte qu’un bourgeon dormant se trouve au milieu de chaque fragment. - Plonger les fragments pendant quelques minutes dans de l’alcool à 70° (moi, je le fais dans de l’alcool ménager à 90°, mais je pense que 70° c’est mieux). - Plonger ensuite les fragments dans une solution d’hypochlorite de calcium sursaturée additionnée de liquide vaisselle pendant 20 minutes et les agiter délicatement de temps en temps. - Puis, pour chaque fragment, à l’aide d’un instrument tranchant désinfecté, commencer à découper la bractée à sa base sur l’un de ses 2 bords, et, avec une pince à épiler, tirer sur le bord de bractée (sur lequel on a amorcé la découpe) afin de retirer toute la bractée. - Après avoir retiré toutes les bractées, plonger à nouveau les fragments de hampe dans une solution d’hypochlorite de calcium sursaturée additionnée de liquide vaisselle pendant 20 minutes en agitant délicatement de temps en temps. Pour les utilisateurs de glovebox, ce dernier bain peut être réalisé à l’intérieur de la boîte, la durée du bain laissant le temps de désinfecter l’intérieur de l’isolateur. - Puis, sans rinçage, planter les fragments de hampe désinfectés sur le milieu de clonage (un milieu équilibré en phytohormones BAP et ANA comme le P793 de PhytoTechnologyLaboratories, additionné d’agar, fera l’affaire dans la plupart des cas). - Après 2 semaines de culture des fragments de hampe, on doit en principe observer une réaction des bourgeons dormants qui commencent à se développer. - A la base des fragments, on peut observer un noircissement du milieu de clonage (si celui-ci est translucide). C’est le signe d’une reprise d’activité des bourgeons, ce qui est plutôt bon signe. - Après quelques mois, on doit en principe observer la formation de feuilles et de racines. Si ce n’est pas le cas, on peut transférer les fragments de hampe sur un milieu de maintenance classique (comme, par exemple, le P668 de PhytoTechnologyLaboratories, additionné d’agar). Normalement, on doit alors observer le développement de feuilles et de racines. - Lorsque la plantule a quelques feuilles et quelques racines d’au moins 3 centimètres, on peut la sortir de son flacon et la repiquer dans de la sphaigne bien humide en oubliant pas de bien l’engraisser. Pour l’instant, j’ai de bons résultats concernant la transformation des bourgeons de phal en plantules (un bourgeon peut donner 1 ou plusieurs plantules) avec le P793. Un hybride intergénérique tel que Doricentrum Pulcherrimin Kadoma ne réagit pas (ou très peu) à ce milieu. Peut-être qu’en ajoutant du BAP … Obtenir une plantule ne signifie pas que le clonage est réussi. En effet, l’utilisation de phytohormones à des doses inadaptées peut provoquer des mutations. Il faut donc attendre la floraison des clones pour pouvoir juger de la réussite de l’expérience. |
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| Auteur: | fred8282 [ Dim Mai 27, 2012 7:13 am ] |
| Sujet du message: | Re: Un protocole de clonage in vitro à partir de hampe florale |
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| Auteur: | lepetitmartien [ Dim Mai 27, 2012 1:12 pm ] |
| Sujet du message: | Re: Un protocole de clonage in vitro à partir de hampe florale |
L'alcool à 90 fait éclater les cellules. Ce qui n'est pas le cas du 70°. Si ton 70° est du Cooper, il contient du camphre et de la tartrazine. La tartrazine a peut-être des effets délétères (cancérigène, mutagène…) et peut provoquer des allergies chez les personnes sensibles à l'aspirine et à l'ibuprofène. Vu le soupçon mutagène, je prendrais plutôt du 90 que je diluerais à 70°. 
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| Auteur: | fred8282 [ Dim Mai 27, 2012 1:24 pm ] |
| Sujet du message: | Re: Un protocole de clonage in vitro à partir de hampe florale |
quand tu dis quelques minutes c'est combien ? et pour les phal du type cervi cornu dont les tiges sont très fines ? merci |
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| Auteur: | Félix134 [ Dim Mai 27, 2012 1:56 pm ] |
| Sujet du message: | Re: Un protocole de clonage in vitro à partir de hampe florale |
lepetitmartien a écrit: L'alcool à 90 fait éclater les cellules. Ce qui n'est pas le cas du 70°. Si ton 70° est du Cooper, il contient du camphre et de la tartrazine. La tartrazine a peut-être des effets délétères (cancérigène, mutagène…) et peut provoquer des allergies chez les personnes sensibles à l'aspirine et à l'ibuprofène. Vu le soupçon mutagène, je prendrais plutôt du 90 que je diluerais à 70°. +1, je suis allergique à la Tartrazine,quand je bois de la Limonade en boîte du commerce,(contient de la Tartrazine.) j'ai des plaques douloureuses d'exéma et des maux de ventre.... 
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| Auteur: | lepetitmartien [ Dim Mai 27, 2012 3:26 pm ] |
| Sujet du message: | Re: Un protocole de clonage in vitro à partir de hampe florale |
C'est un aspect que je viens de découvrir, c'est pas génial… Ceci dit, merci pour le tuto Franck, beau boulot 
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| Auteur: | franck b77 [ Lun Mai 28, 2012 11:27 pm ] |
| Sujet du message: | Re: Un protocole de clonage in vitro à partir de hampe florale |
fred8282 a écrit: quand tu dis quelques minutes c'est combien ? et pour les phal du type cervi cornu dont les tiges sont très fines ? merci 1 à 5 minutes. J'avoue que je ne compte pas toujours ... Le problème avec le cornu cervi, c'est qu'il fleurit plusieurs fois sur la même hampe il me semble. Dans ce cas, le sacrifice d'une hampe prive de futures floraisons. Par contre, je ne vois pas le problème de la finesse de la tige ... Y a-t-il des bourgeons dormants à la base de la hampe ? |
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| Auteur: | fred8282 [ Mar Mai 29, 2012 7:02 am ] |
| Sujet du message: | Re: Un protocole de clonage in vitro à partir de hampe florale |
bjr, les keiki se developppent sur les deux premiers bourgeons. bonne journée fred |
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